Protocoles de congélation d’ovules

Comparons les deux méthodes de conservation des ovocytes, l'une lente (congélation lente) et l'autre ultra-rapide (vitrification), en ce qui concerne la survie des ovocytes, le taux de fécondation, le développement des embryons après la fécondation, la formation du fuseau méiotique dans les ovocytes et leur alignement chromosomique.

Les protocoles suivis pour réaliser la congélation et la décongélation lente des ovocytes ainsi que la vitrification et dévitrification sont expliqués ci-dessous:

Congélation - Décongélation ovocytaire lente

Protocole de congélation lente modifiée

Cette technique se base sur la méthode de congélation de Fabbri et ses collaborateurs. Après avoir dénudé les ovocytes, ils ont été plongés dans une solution de fluide tubaire humain (HTF) modifié d'une concentration de 1,5 M de 1,2-propanédiol (PROH).

Ensuite, ils ont été transférés pendant 10 minutes dans le milieu de congélation composé de 1,5M PROH et de 0,3 M de saccharose.

Les ovocytes se sont divisés en groupes de 2 ou de 3 et on en a rempli des paillettes qu'on a thermoscellées et placées dans un congélateur programmable à 25ºC, où ils ont été refroidis petit à petit en suivant les étapes suivantes:

• Refroidissement de 2ºC par minute.
• Une fois à -7ºC, on a réalisé un “seeding” manuel et maintenu les ovocytes à cette température pendant 10 minutes.
• On a poursuivi le refroidissement en diminuant la température de 0,3ºC par minute, jusqu'à atteindre -33ºC.
• On a plongé les paillettes dans de l'azote liquide à -196ºC.

Protocole de décongélation lente modifiée

Les paillettes ont été extraites suivant ce protocole:

• Les paillettes ont été laissées à température ambiante durant 40 secondes.
• Elles ont été immergées dans un bain-marie à 31ºC pendant 60 secondes.
• Elles ont été consécutivement lavées et hydratées, pour éliminer les restes de cryoprotecteur.
• On les a maintenues dans le milieu HTF dans l'incubateur à 37ºC durant 2-3 heures avant de les introduire par micro-injections (ICSI).

Vitrification - Dévitrification ovocytaire

Protocole de vitrification

Pour procéder à la vitrification des ovocytes, on a suivi les étapes suivantes:

• Les ovocytes ont été immergés dans un milieu équilibré composé d'éthylène glycol (EG) et de PROH (à 7,5% v/v) durant 5 minutes.
• Ils ont été transférés dans un milieu de vitrification composé de EG et de PROH (à 15% v/v) et de 0,5 M de saccharose, pendant 45 à 60 secondes.
• Ils ont été placés dans les paillettes spécialement conçues à cet effet et immergés directement dans de l'azote liquide.
• Ils ont été conservés vitrifiés pendant un mois.

Protocole de dévitrification

L'entité commerciale utilisée a été la même que pour la vitrification. Les étapes ont été les suivantes:

• La paillette a été introduite dans 1 M de saccharose à 37ºC pendant 3 minutes, passant de façon décroissante dans 3 concentrations différentes de saccharose pendant 1 minute chacune (1 M, 0,50 M et 0,25 M).
• Les ovocytes ont été transférés dans un milieu de lavage, deux fois de suite.
• Après 2-3 heures de culture, on a examiné l'intégrité de la membrane et transféré les ovocytes intacts par micro-injection (ICSI).